METODA DILUSI

METODA DILUSI

Penentuan KHM dilakukan dengan metoda dilusi menggunakan “96-Well microtiterplate” dengan cara sebagai berikut :

1. Pembuatan media pembenihan

1. Nutrient Broth (NB) (Merck^Ò)

Sebanyak 8 gram serbuk Nutrient Broth dilarutkan dalam 1 liter air suling dalam erlenmeyer kemudian dipanaskan di atas hotplate menggunakan stirer magnetik sampai terbentuk larutan jernih. Tutup erlenmeyer dengan sumbat kapas, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121^oC dan tekanan 15 lbs selama 15 menit.

2. Sabouraud Dextrose Broth (SDB) (Merck^Ò)

Sebanyak 30 gram serbuk Sabouraud Dextrose Broth dilarutkan dalam 1 liter air suling dalam erlenmeyer kemudian dipanaskan di atas hotplate menggunakan stirer magnetik sampai terbentuk larutan jernih. Tutup erlenmeyer dengan sumbat kapas, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121^oC dan tekanan 15 lbs selama 15 menit.

2. Pembuatan stok kultur biakan

Sebanyak satu ose koloni bakteri diambil dari biakan murni, kemudian di suspensikan dalam 10 ml media NB untuk bakteri lalu dishaker selama 12 jam, 120 rpm pada suhu 27^oC.

3. Pembuatan suspensi kultur mikroba

Sejumlah 100 µl stok kultur ini disuspensikan dalam 10 ml media NB kemudian dihomogenkan dengan vorteks. Kekeruhan suspensi bakteri uji kemudian diukur pada l 580 nm sehingga didapatkan transmitan 25%. Sedangkan untuk jamur, ke dalam stok kultur ditambahkan 10 ml media SDB, dikocok kuat agar hypha lepas, dan disaring dengan kain kasa steril sehingga diperoleh filtrat yang berupa suspensi spora. Kemudian filtrat tadi dilarutkan dalam 50 ml media SDB, dihomogenkan dengan vorteks dan ukur transmitannya dengan spektrofotometer UV-Vis sehingga didapat suspensi dengan transmitan 90%.    

4. Pembuatan larutan uji

Senyawa hasil isolasi ditimbang seberat 5 mg dan dilarutkan dalam 5 ml pelarut metanol sehingga didapatkan larutan uji dengan konsentrasi 1000 ppm.

5. Penentuan KHM

Sebanyak 100 ml suspensi kultur mikroba dimasukkan ke dalam lubang microtiterplate no 2-10, sedangkan pada lubang ke-1 dimasukkan sebanyak 180 ml. Dan pada lubang ke-11 dan ke-12 dimasukkan 90 ml berturut-turut sebagai kontrol negatif dan positif. Kemudian pada lubang ke-1 tambahkan 20 ml sampel, dihomogenkan dengan cara mengaduk suspensi dalam microtiterplate, kemudian pipet 100 ml dari lubang ke-1 dan dimasukkan pada lubang ke-2, dari lubang ke-2 dipipet sebanyak 100 ml dan dimasukkan ke lubang ke-3 dan dihomogenkan, begitu seterusnya hingga lubang ke-10, dengan 100 ml larutan terakhir dibuang. Untuk kontrol negatif tambahkan 10 ml metanol pada lubang ke-11, dan 10 ml tetrasiklin pada lubang ke-12 sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 16 ppm untuk bakteri dan klotrimazol dengan konsentrasi 3 ppm. Kemudian microtiterplate diinkubasi dalam lemari aseptis selama 24 jam pada suhu 27^oC. Pengamatan dilakukan terhadap kekeruhan secara visual setelah masa inkubasi. Terbentuknya larutan bening  menunjukkan tidak terjadi pertumbuhan bakteri. Konsentrasi terkecil yang meyebabkan tidak terjadi pertumbuhan bakteri merupakan nilai KHM-nya.

Lampiran X.  Penentuan KHM Senyawa X Dengan Metoda Dilusi

Tabel X.   Hasil Penentuan KHM Senyawa X terhadap Mikroba Uji Dengan Metoda Dilusi

Mikroba Uji	Konsentrasi (ppm)								KHM (ppm)
	1000	500	250	125	62,5	31,25	15,625	7,8125
Staphylococcus aureus	+	+	+	-	-	-	-	-	250
Staphylococcus epidermidis	+	+	+	+	-	-	-	-	125
Micrococcus luteus	+	+	-	-	-	-	-	-	250
Pseudomonas aeruginosa	+	+	+	+	+	-	-	-	62,5
Escherichia coli	+	+	+	+	-	-	-	-	125
Candida albicans	+	+	+	+	-	-	-	-	125
Tricophython mentogrophytes	+	+	+	+	-	-	-	-	125

                                          

Keterangan:     + Bening (aktif)

                        -  Keruh (tidak aktif)

           

Lampiran 8.   (lanjutan)

Gambar 24. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Senyawa X.

Keterangan :   

1   :   Pengenceran 1000 ppm

2   :   Pengenceran 500 ppm

3   :   Pengenceran 250 ppm

4   :   Pengenceran 125,5 ppm

5   :   Pengenceran 62,5 ppm

6   :   Pengenceran 31,25 ppm

7   :   Pengenceran 15,625 ppm

8   :   Pengenceran 7,8125 ppm

9   :   Pengenceran 3,91 ppm

10 :   Pengenceran 1,95 ppm

11 :   Kontrol positif, tetrasiklin

12 :   Kontrol negatif, metanol

Lampiran 8.   (lanjutan)

Gambar 25. Hasil Uji Aktivitas Antijamur Senyawa X.

Keterangan :   

1   :   Pengenceran 1000 ppm

2   :   Pengenceran 500 ppm

3   :   Pengenceran 250 ppm

4   :   Pengenceran 125,5 ppm

5   :   Pengenceran 62,5 ppm

6   :   Pengenceran 31,25 ppm

7   :   Pengenceran 15,625 ppm

8   :   Pengenceran 7,8125 ppm

9   :   Pengenceran 3,91 ppm

10 :   Pengenceran 1,95 ppm

11 :   Kontrol positif, klotrimazol

12 :   Kontrol negatif, metanol

Laminar Air Flor (LAF)

LAMINAR AIR FLOR

(LAF)

Laminar Air Flow adalah meja kerja steril untuk melakukan kegiatan inokulasi/ penanaman. Laminar Air Flow merupakan suatu alat yang digunakan dalam pekerjaan persiapan bahan tanaman, penanaman, dan pemindahan tanaman dari sutu botol ke botol yang lain dalam kultur in vitro. Alat ini diberi nama Laminar Air Flow Cabinet, karena meniupkan udara steril secara kontinue melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari, debu dan spora-spora yang mungkin jatuh kedalam media, waktu pelaksanaan penanaman. Aliran udara berasal dari udara ruangan yang ditarik ke dalam alat melalui filter pertama (pre-filter), yang kemudian ditiupkan keluar melalui filter yang sangat halus yang disebut HEPA (High efficiency Particulate Air FilterI), dengan menggunakan blower.

Laminar Air Flow (LAF) digunakan sebagai ruangan untuk pengerjaan secara eseptis. Prinsip penaseptisan suatu ruangan berdasarkan aliran udara keluar dengan kontaminasi udara dapat diminimalkan.

Pada Laminar Air Flow, terdapat 2 macam filter:

1.      Pre-filter, yang menggunakan saringan pertama terhadap debu-debu dan benda-benda yang kasar. Pori-porinya kira-kira 5 mm sehingga efisiensinya dapat mencapai 95 mm untuk objek-objek yang ≥ 5 mm.

2.      HEPA filter dengan pori-pori 0.3 (m dan terdapat pada bidang keluar udara kearah permukaan tempat kerja.

Pre-filter harus sering dibersihkan dengan cacum cleaner dan sebaiknya diganti 1 tahun sekali. Namun HEPA filter diganti setelah melalui pemeriksaan dengan particulate count atau dengan alat yang disebut magnehelic gauge. Laminar air flow cabinet ada yang dilengkapi dengan lampu U.V., ada juga yang tanpa. Pada laminar air flow cabinet yang tidak dilengkapi dengan lampu U.V., blower harus dijalankan terus menerus walaupun laminar air flow cabinet tersebut sedang tidak dipergunakan. Hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja didalam laminar air flow tersebut. Pada laminar air flow yang dilengkapi dengan lampu U.V., dianjurkan agar menyalakan lampu U.V. minimum 30 menit sebelum laminar air flow digunakan. Ketika laminar air flow sedang digunakan, lampu U.V. harus dimatikan, sedangkan blower dijalankan. Blower pada laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu U.V., hanya dijalankan pada saat laminar air flow sedang digunakan.

Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow yaitu:

1.      Lampu alkohol/Bacti cinerator.

2.       Wadah alkohol: botol/gelas piala ≥ 250 ml.

3.      Pinset, skalpel, gunting, dan jarum.

4.      Petri-dish steril.

5.      Disceting Microscope, bila sedang isolasi meristim.

6.      Kertas tissue/kapas.

7.      Sprayer berisi alkohol 70% (tidak harus dalam cabinet).

Laminar Air Flow sering disebut juga sebagai Biological Safety Cabinet (BSC) yaitu alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC/LAF mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasisinar UV beberapa jam sebelum digunakan. Prosedur penggunaan BSC/FAL adalah sebagai berikut:

1.      Hidupkan lampu UV selama 2 jam, selanjutnya matikan segera sebelum mulai bekerja.

2.      Pastikan kaca penutup terkunci dan pada posisi terendah.

3.      Nyalakan lampu neon dan blower.

4.      Biarkan selama 5 menit.

5.      Cuci tangan dan lengan dengan sabun gemisidal / alkohol 70 %.

6.      Usap permukaan interior LAF/BSC dengan alkohol 70 % atau desinfektan yang cocok dan biarkan menguap.

7.      masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan, jangan terlalu penuh (overload) karena memperbesar resiko kontaminan.

8.      Atur alat dan bahan yang telah dimasukan ke LAF/BSC sedemikian rupa sehingga efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar steril.

9.      Jangan menggunakan pembakar Bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi gunakan yang berbahan bakar gas.

10.  Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas kerja.

11.  setelah selesai bekerja, biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari BSC

12.  Usap permukaan interior LAF/BSC dengan alkohol 70 % dan biarkan menguap lalu tangan dibasuh dengan desinfektan.

13.  Matikan lampu neon dan blower.

Hal yang perlu diperhatikan dalam penggunaan Laminar Air Flow (LAF) adalah sebagai berikut :

1.      Jangan meletakkan lampu bunsen terlalu dekat dengan filter dan alkohol untuk merendam peralatan kultur.

2.      Jangan menumpuk alat-alat, botol-botol media, dan lain-lain benda di depan tempat bekerja sehingga menghalangi aliran udara.

3.      Jangan mencelupkan alat tanam dengan nyala api ke dalam alkohol (nyala api alkohol yang terdapat pada alat tanam, tidak terlihat dengan jelas di tempat
yang terang HATI-HATI !!!).

4.      Jangan mendekati lampu bunsen, dengan tangan yang baru disemprot alkohol atau spiritus.

5.      Bersihkan Laminar Air Flow Cabinet, setelah selesai bekerja. Jangan meninggalkan botol bekas, kapas bekas, dan sebagainya di dalam LAF.

Prinsip Kerja dari Laminar Air Flow (LAF) adalah sebagai berikut :

a.       Laminar Air Flow digunakan sebagai meja kerja steril untuk kegiatan inokulasi/ penanaman.

b.      Laminar Air Flow mengutamakan adanya hembusan udara steril yang digerakkan oleh blower yang disaring oleh HEPA Filter.

c.       Sebelum dioperasikan Laminar Air Flow harus dinyalakan minimal 30 menit dan harus dilakukan penyemprotan dengan alcohol agar alat dan ruang kerja tersebut terjamin kesterilannya.

d.      Pada saat melaksanakan pekerjaan, harus dinyalakan blowernya yang berfungsi sebagai penghembus udara steril dan lampu TL sebagai penerang.

e.       Agar Laminar Air Flow dapat difungsikan setiap saat, pemeliharaan dan perawatan alat harus selalu dilakukan.

Cara Perawatan Laminar Air Flow (LAF) :

Apabila Laminar Air Flow Cabinet selesai dipergunakan, untuk langkah perawatannya yaitu antara lain :

a.       Membersihkan semua sisa potongan eksplan dengan tissue.

b.      Bakarlah (pisau scalpel, pinset) dengan menyemprotkan terlebih dahulu dengan alkohol 95% dan tempatkan kembali dalam keadaan siap pakai.

c.       Matikan blower dengan memijit tombol “off”.

d.      Semprotkan ruang kerja dengan alkohol.

e.       Tutup kembali pintu Laminar Air Flow Cabinet.

f.       Matikan lampu TL.

g.      Nyalakan kembali lampu UV.

Daftar Pustaka

http://vedcablog.blogspot.com/2009/03/laminar-air-flow-cabinet-adalah-suatu.html

http://www.scribd.com/doc/28942677/Laminar-Air-Flow

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/analisis-mikrobiologi/analisis-mikrobiologi/

http://mediakulturjaringan.blogspot.com/2010/08/merawat-dan-mengoprasikan-peralatan.html