sains school: METODA DILUSI

METODA DILUSI

Penentuan KHM dilakukan dengan metoda dilusi menggunakan “96-Well microtiterplate” dengan cara sebagai berikut :

1. Pembuatan media pembenihan

Nutrient Broth (NB) (Merck^Ò)

Sebanyak 8 gram serbuk Nutrient Broth dilarutkan dalam 1 liter air suling dalam erlenmeyer kemudian dipanaskan di atas hotplate menggunakan stirer magnetik sampai terbentuk larutan jernih. Tutup erlenmeyer dengan sumbat kapas, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121^oC dan tekanan 15 lbs selama 15 menit.

Sabouraud Dextrose Broth (SDB) (Merck^Ò)

Sebanyak 30 gram serbuk Sabouraud Dextrose Broth dilarutkan dalam 1 liter air suling dalam erlenmeyer kemudian dipanaskan di atas hotplate menggunakan stirer magnetik sampai terbentuk larutan jernih. Tutup erlenmeyer dengan sumbat kapas, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121^oC dan tekanan 15 lbs selama 15 menit.

2. Pembuatan stok kultur biakan

Sebanyak satu ose koloni bakteri diambil dari biakan murni, kemudian di suspensikan dalam 10 ml media NB untuk bakteri lalu dishaker selama 12 jam, 120 rpm pada suhu 27^oC.

3. Pembuatan suspensi kultur mikroba

Sejumlah 100 µl stok kultur ini disuspensikan dalam 10 ml media NB kemudian dihomogenkan dengan vorteks. Kekeruhan suspensi bakteri uji kemudian diukur pada l 580 nm sehingga didapatkan transmitan 25%. Sedangkan untuk jamur, ke dalam stok kultur ditambahkan 10 ml media SDB, dikocok kuat agar hypha lepas, dan disaring dengan kain kasa steril sehingga diperoleh filtrat yang berupa suspensi spora. Kemudian filtrat tadi dilarutkan dalam 50 ml media SDB, dihomogenkan dengan vorteks dan ukur transmitannya dengan spektrofotometer UV-Vis sehingga didapat suspensi dengan transmitan 90%.

4. Pembuatan larutan uji

Senyawa hasil isolasi ditimbang seberat 5 mg dan dilarutkan dalam 5 ml pelarut metanol sehingga didapatkan larutan uji dengan konsentrasi 1000 ppm.

5. Penentuan KHM

Sebanyak 100 ml suspensi kultur mikroba dimasukkan ke dalam lubang microtiterplate no 2-10, sedangkan pada lubang ke-1 dimasukkan sebanyak 180 ml. Dan pada lubang ke-11 dan ke-12 dimasukkan 90 ml berturut-turut sebagai kontrol negatif dan positif. Kemudian pada lubang ke-1 tambahkan 20 ml sampel, dihomogenkan dengan cara mengaduk suspensi dalam microtiterplate, kemudian pipet 100 ml dari lubang ke-1 dan dimasukkan pada lubang ke-2, dari lubang ke-2 dipipet sebanyak 100 ml dan dimasukkan ke lubang ke-3 dan dihomogenkan, begitu seterusnya hingga lubang ke-10, dengan 100 ml larutan terakhir dibuang. Untuk kontrol negatif tambahkan 10 ml metanol pada lubang ke-11, dan 10 ml tetrasiklin pada lubang ke-12 sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 16 ppm untuk bakteri dan klotrimazol dengan konsentrasi 3 ppm. Kemudian microtiterplate diinkubasi dalam lemari aseptis selama 24 jam pada suhu 27^oC. Pengamatan dilakukan terhadap kekeruhan secara visual setelah masa inkubasi. Terbentuknya larutan bening menunjukkan tidak terjadi pertumbuhan bakteri. Konsentrasi terkecil yang meyebabkan tidak terjadi pertumbuhan bakteri merupakan nilai KHM-nya.

Lampiran X. Penentuan KHM Senyawa X Dengan Metoda Dilusi

Tabel X. Hasil Penentuan KHM Senyawa X terhadap Mikroba Uji Dengan Metoda Dilusi

Mikroba Uji	Konsentrasi (ppm)								KHM (ppm)
Mikroba Uji	1000	500	250	125	62,5	31,25	15,625	7,8125	KHM (ppm)
Staphylococcus aureus	+	+	+	-	-	-	-	-	250
Staphylococcus epidermidis	+	+	+	+	-	-	-	-	125
Micrococcus luteus	+	+	-	-	-	-	-	-	250
Pseudomonas aeruginosa	+	+	+	+	+	-	-	-	62,5
Escherichia coli	+	+	+	+	-	-	-	-	125
Candida albicans	+	+	+	+	-	-	-	-	125
Tricophython mentogrophytes	+	+	+	+	-	-	-	-	125

Keterangan: + Bening (aktif)

- Keruh (tidak aktif)

Lampiran 8. (lanjutan)

Gambar 24. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Senyawa X.

Keterangan :

1 : Pengenceran 1000 ppm

2 : Pengenceran 500 ppm

3 : Pengenceran 250 ppm

4 : Pengenceran 125,5 ppm

5 : Pengenceran 62,5 ppm

6 : Pengenceran 31,25 ppm

7 : Pengenceran 15,625 ppm

8 : Pengenceran 7,8125 ppm

9 : Pengenceran 3,91 ppm

10 : Pengenceran 1,95 ppm

11 : Kontrol positif, tetrasiklin

12 : Kontrol negatif, metanol